[问题]

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-05-18 9:31

大家好，我在论坛中看到了有关免疫共沉淀的内容，我最近也想做，但是我买的protein A agorose引起的非特很严重，我今天把protein A agorose取10微升加loading buffer煮沸5分钟，然后做western，结果出来的条带一条挨一条，几乎全是条带了。我就纳闷儿了，不就是protein A 吗，怎么会有那么多的条带，是我处理的方法不对吗？我该怎么做

tiffany · Post by **tiffany** » 2009-05-18 9:39

你的loading buffer SDS 多少？一般用2X的 sample buffer elude的，我们是90度，10分钟，还好。

还有你做western的时候，block了多久？block久点儿会不会有帮助？

silkworm · Post by **silkworm** » 2009-05-18 9:54

你还是给珠子的厂商打电话问问吧。
另外你的western恐怕也值得研究一下，怎么western的抗体会认珠子上弄下来的东西的。

另，再看看你上次的发言，是说“我做实验遇到的问题是在西点的时候，蛋白G或蛋白A会出来一条非特异的带，和我的目的蛋白非常接近，有时候会覆盖目的带。” 而这次的问题就变成很多很多条带了。到底哪个作准？

而且，上次大家给你出主意，还问了不少问题，你的回答是？又问新的了。问答问答，得有来有往。我的回答到此。

森林的火焰 · Post by **森林的火焰** » 2009-05-18 10:43

你用什么block的？一抗是什么？买的还是自己做的？你的running buffer里头有没有记得加SDS?有人用BSA来block，是可以提高灵敏度，但背景也特高。
另外，同蚕。

putaopi · Post by **putaopi** » 2009-05-18 14:24

完全看不懂问题的人，进来仰慕一下科学家们。各位继续。

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-05-19 1:29

我的loading buffer是有SDS的，用的4X，我煮了两个，一个是95度5分钟，另一个是煮沸3分钟，都是先加buffer煮的，block是用的百分之五的脱脂奶，封闭一小时，一抗是买来的，兔的多克隆抗体

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-05-19 1:46

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另，再看看你上次的发言，是说“我做实验遇到的问题是在西点的时候，蛋白G或蛋白A会出来一条非特异的带，和我的目的蛋白非常接近，有时候会覆盖目的带。” 而这次的问题就变成很多很多条带了。到底哪个作准？

而且，上次大家给你出主意，还问了不少问题，你的回答是？又问新的了。问答问答，得有来有往。我的回答到此。[/quote

我上的不够及时，没能看到之前的那个帖子，而且我在国内，有时差会的不够及时，还请谅解。另外，这个实验不是从我这里开始的，师姐开始做的，那时候我还不在实验室，上次说的一条非特异的带是师姐告诉我的，让我先想想

tiffany · Post by **tiffany** » 2009-05-19 8:33

要是trouble shooting的话，不妨拿你的protein A珠子就跑个蛋白胶，silver stain／考马司亮蓝染一下儿，看有多少条带，跟你的western对不对的上。

lucoco · Post by **lucoco** » 2009-05-19 14:32

tiffany wrote:要是trouble shooting的话，不妨拿你的protein A珠子就跑个蛋白胶，silver stain／考马司亮蓝染一下儿，看有多少条带，跟你的western对不对的上。

正打算建议，不过，一般做ip才加多少的珠子阿，我一般都是加个4ul，sds-page看不到吧。但是仍然建议做，既然楼主碰到的这个问题这么怪。说不定厂家合成珠子的时候弄错配方了，接了太多proteinA.

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-05-19 20:05

4ul就好吗，我的protocol建议20ul，我取10来跑胶，正跑着呢，一会儿染一下看看

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-06-06 22:12

我和公司联系了一下，还是决定买新的beads了

忘了吧8356 · Post by **忘了吧8356** » 2009-06-06 22:13

beads在用之前为什么要用elution buffer洗啊