恶人谷

我2006年中加入现在这个实验室，头一件事就是用我做好的ＤＮＡ打老鼠胚胎干细胞(ES cell)，制造转基因老鼠。
转基因老鼠的制作分这么几步：第一：把线状ＤＮＡ转化进胚胎干细胞里，指望同源重组，修改过的DNA能整合到需要的位点上去。确定ES cell转化无误以后，就要把这些个ES cell跟一些野生型的糅合在一起，做成了一个早期小胚胎，植进母老鼠的子宫。这样生出来的第一代老鼠是黑白花儿的嵌合体（转基因ES cell表型是黑毛色，野生型是白毛色。这样可以看出来转基因细胞占第一代老鼠身体的多少比例。然后就是一个买彩票的过程了：我们希望转基因细胞能有很多变成生殖细胞，在公老鼠来说就是精子了。如果一个精子携带的染色体是由转基因细胞来的，那么它生出来的下一代就是黑毛色。所以我们把黑白花儿第一代表现为公的老鼠跟白母老鼠交配，如果生出来的小老鼠全是黑的，就说明有希望：有一半的小老鼠可能是转基因的（因为另一条染色体还是野生型）。如果生出来全是白的，就说明没转成。
今天收到一条激动人心的消息：我去年春天做好的黑白花儿嵌合体老鼠，老鼠房技术员一直孜孜不倦的让它们交配成婚，看生出来的小老鼠的表型。迄今为止已经生过了五六窝，都没有转成功的。结果最近，生了一窝黑的。我激动之余一算这老鼠已经相当于不惑之年，算是中发花，到这会才给出点靠谱的结果。还是中年人靠得住啊，老话儿怎么说的来着？嘴上没毛，办事不牢

我看了两遍，好容易把最后一段（觉着）看懂了。说啥都是露怯，恭喜一下吧。

wow 真专业。

咳，不就是她要小黑老鼠，得了小黑老鼠么？我看明白了。头脑简单的说。恭喜

对了，这是不是说明基因转化为生殖细胞需要一段时间？还是说，老鼠某个时间段会集中表现某些基因？

我拿出资深TA的范儿，对小火焰说：
实验报告打回去重新写，hint: 用基因型做一个图表。

要塞进去的基因跟黑色基因是连一起的么？

要塞的是什么基因哪？人的吧？如果你全用英文解释，不用abbreviations, 我还能蒙出些意思来。

ES cell = embryonic stem cells 在美国不让搞的，除非你用最早的几个cell line里分出来的后代，或者用私人钱来研究。Thanks to our great leader who loves life and hates abortion，大家研究也不用搞了。Any scientist who votes for conservatives deserves to have his or her funding yanked.

Any scientist who votes for conservatives deserves to have his or her funding yanked.

哇，咒的真够狠的。

问点外行问题。美国这边好像也有很多作转基因老鼠的，他们不用 ES cell 是吗？

恭喜火焰. 希望这窝小老鼠如愿继续全部生小小黑老鼠。(汗, 我错得也太离谱了, 这F1肯定都是杂合体的, F2赶紧生很多小小黑老鼠, 出来纯合体吧. )

做人的ES不行，做老鼠应该没问题吧？

确切地说，是Human embryonic stem cell在美国不能得到公家的funding。老鼠的随便搞。人类的只能从private渠道得到funding。当然人类的在哪里都是有限制的，但是限制不大一样。比如那个用人类细胞做了嵌合体羊的，我就相当汗竟然可以给做

我现在在狂喜之中，图表的啥是懒得画啦，凑合着说说吧：

我要打算做的是“conditional knock-out"，就是说，可以做到，在某些组织里这个基因一点没事，在另一些组织里就把它剔除掉。做的方法是：把要删掉的部分用一对“括号“括起来，这对括号叫loxP site。当另一个ＤＮＡ剪切酶Cre遇上loxP site的时候，它就会把一对loxP site之间的ＤＮＡ全剪掉，只剩下一个loxP site。为达到这个目的，就要对我感兴趣的基因进行精细加工，在整个序列段儿里插进一对loxP site。日后，再跟带有Cre基因的小老鼠杂交，就可以把这个基因删除啦。

ES cell都是从活老鼠来的。从黑毛老鼠来的ES cell就带有黑毛基因，从白毛老鼠来的就带有白毛基因。所以把转基因ES cell注射到野生型白毛胚胎里去以后，生出来的小老鼠是又黑又白，花的。这一代我们叫chimera，嵌合体。因为ES cell可以分化成除胎盘外所有的胚胎组织，所以从毛色有多黑，我们就可以大致推断这个小花老鼠的肝有多少是ES cell贡献的，肾有多少是ES cell贡献的。。。最重要的是，生殖细胞有多少是ES cell贡献的。因为纯由ES cell贡献产生的生殖细胞，进入下一代以后，才能使下一代老鼠成为转基因的，而不再是chimera嵌合体老鼠。

这里头还有一个trick:用来做转基因操作的ES cell是雄的，ＸＹ染色体。用来注射这些ES cell的胚胎我们挑雌的，ＸＸ。所以生出来的嵌合体是部分雄部分雌的。因为只有雄的才能发育出雄性生殖腺，表现为雄性，所以那些能交配的雄性嵌合体，在生殖腺里头带有转了基因的生殖细胞的机会要大得多。

我们挑毛色黑的最多的嵌合体雄老鼠跟白色的雌老鼠交配，如果黑老鼠的精子是来自于ES cell，那么黑毛对白毛是显性，生出来的下一代就是黑的；这些老鼠里有一半可能带有被我加工过的那一段ＤＮＡ。因为我只能加工一对染色体中的一条，另一条仍然是野生状态。但如果是白的，就说明没有任何来自于ES cell的希望。
至于说连锁的问题：我修饰的基因和黑毛基因没有连锁，因为在这个过程中，没有一步涉及到黑白杂交以后再随机分离，象普通杂交那样。但是黑毛小老鼠如果再兄弟姐妹交配产生下一代，就会什么毛色都有了：因为黑毛小老鼠其实带了至少一半的，来自于白毛妈妈的基因。而且用来做实验的这一株 ＥＳ cell的遗传背景也是相当混杂的，不过毛色基因是黑的而已。

我在这间实验室一共做了两种不同的转基因小鼠，其中一株很乖很听话，去年夏天已经转成了，就是conditional knockout line；这一窝是另一种修饰：我给这个基因加了一点点序列，编码的是一个tag。这样表达出来的蛋白质，就很容易用商业抗体标记上。因为给一个蛋白做抗体也是件碰运气的事，不一定一下子就能做得出来。相比之下，给一个蛋白加上一个已经有很好的抗体的小标志，是普遍使用的做法。

但这系列老鼠不知道为什么，足转了五六胎才转成。算它命大。因为一般来说生两胎全是白的就杀了重来。但我们中间有搬动物房，鸡飞狗跳。我也在且转了基因的ES cell试图分化出心肌细胞，所以基本等于放弃希望。没想到中年老鼠发愤图强，居然生出来了

仰慕的看着科学家。

火焰，为了增加可读性，我建议你把段落之间用两个回车分开，这样段间距好歹可以大些，然后我读串行的可能性会低些。。。

火星狗 wrote: 仰慕的看着科学家。

你起啥哄？你不也是做生物的么 不外这么几个模型，基本道理差不多的。我觉得果蝇里玩的遗传技巧才叫眼花缭乱，好多我现在还不大明白。

今天生物女青年们人品大爆发啊，给咱这些科盲进行了大量图文并茂，深入浅出的科普工作。

是是是，两句话之间少了一段过渡的。Of mice and men.

在老鼠上搞成的技术还不是为了用在人身上的？

立场不变。

Knowing wrote:今天生物女青年们人品大爆发啊，给咱这些科盲进行了大量图文并茂，深入浅出的科普工作。

心声。
我觉得生物青年的神经不是一般的粗大。

立场不变。

掩面，下。

我觉得用黑白花的程度来判断转基因的程度这个 idea 真是 cute ，我最喜欢这种简单概念了。那天听 targeted drug delivery 的一个 seminar ，完全是出于外行看热闹的心情去的。关于怎样把药物精确的 deliver 到 tumor region，关键的一步并不是什么 tough 的高难技术，tumor 区域的血管是 leaky 的，到了那个区域，药物自然就从血管里扩散到周边区域，真是 simple 又 elegant 的 idea.

老子看了两遍，还是没有看懂。

给个物理公式瞅瞅？

火星狗 wrote:

立场不变。

掩面，下。

我觉得用黑白花的程度来判断转基因的程度这个 idea 真是 cute ，我最喜欢这种简单概念了。那天听 targeted drug delivery 的一个 seminar ，完全是出于外行看热闹的心情去的。关于怎样把药物精确的 deliver 到 tumor region，关键的一步并不是什么 tough 的高难技术，tumor 区域的血管是 leaky 的，到了那个区域，药物自然就从血管里扩散到周边区域，真是 simple 又 elegant 的 idea.

咦这个难道不是很普遍的idea么？比如track脑恶性肿瘤的边缘的一种方法就是往血管里打radio active的药然后再拍照，因为肿瘤产生的肿瘤没有血脑屏障，所以可以很好的区分肿瘤和非肿瘤。

足够让我这个外行仰慕一下了。

我一般为此兴奋不是这个idea多么简单有效，而是：好容易有一个我能听懂的了！ 刚才好悬睡着了。。。

火星狗 wrote:

立场不变。

我觉得用黑白花的程度来判断转基因的程度这个 idea 真是 cute ，我最喜欢这种简单概念了。那天听 targeted drug delivery 的一个 seminar ，完全是出于外行看热闹的心情去的。关于怎样把药物精确的 deliver 到 tumor region，关键的一步并不是什么 tough 的高难技术，tumor 区域的血管是 leaky 的，到了那个区域，药物自然就从血管里扩散到周边区域，真是 simple 又 elegant 的 idea.

这个很精确吗? 跟加个单克隆抗体TAG比, 精确度怎么样?

这得问专家，我真的答不上来。我就是觉得什么都不用作就可以 achieve 80% of your goal 是件挺可爱的事情，最容易迷倒我这种一知半解的外行。

orangetabby wrote:

火星狗 wrote:

立场不变。

我觉得用黑白花的程度来判断转基因的程度这个 idea 真是 cute ，我最喜欢这种简单概念了。那天听 targeted drug delivery 的一个 seminar ，完全是出于外行看热闹的心情去的。关于怎样把药物精确的 deliver 到 tumor region，关键的一步并不是什么 tough 的高难技术，tumor 区域的血管是 leaky 的，到了那个区域，药物自然就从血管里扩散到周边区域，真是 simple 又 elegant 的 idea.

这个很精确吗? 跟加个单克隆抗体TAG比, 精确度怎么样?

这个的目的好象是不同的：用单抗是为了显示某蛋白或大分子的位置，火星狗说的这个，是要把药物送到被肿瘤侵入的组织的周边，肿瘤―组织交界处。有多么精确倒不一定需要。我猜这种药物是用来抑制血管生成因子或者表皮生长因子一类的信号分子的，因为肿瘤分泌出很多这种信号来诱使毛细血管向它的方向生长好给它送吃的送氧气，健康组织里这种分子少得多。所以即使有一定浓度的药物存在对健康组织影响也不大。

用抗体来标记有时候也是不一定精确的：比如在发育过程中有很多信号分子，在小胚胎的背－腹轴或者前－后轴形成一个梯度来决定哪个方向是未来的背或腹，前或后。这些信号分子一般是扩散出去的。所以要标记这些信号分子的位置，靠抗体就不如用reporter gene染色。

我就看懂了小火焰要黑老鼠得到了黑老鼠, 心想事成, 美梦成真. 恭喜恭喜.

装上 Monoclonal antibodies 的药物分子也有它的问题，容易被自身免疫系统吃掉，还有另一个副作用我忘记是什么了。现在有办法用 liposomes 把cytotoxic 药物运送到肿瘤附近，然后靠着肿瘤血管“漏”的特性而渗透进去。如果目的是消灭肿瘤血管anti-angiogenesis 那么就不需要太准确地打靶，送到，杀死血管，就行了。

原来你们说的是antibody-tag, 我还以为是epitope-tag了以后再用抗体来找

小火焰手气不错啊，两年两支转基因鼠，不容易，不容易！
那个既然碰上了，我就追问chimira的事情。你说把es细胞打进胚胎，那是开始分化
的胚胎么？我觉得这事儿很神奇，胚胎发育过程中还能加进来的外来细胞，还能发育成正常老鼠。还有你加工过的那片dna怎么重组进去的呢？
曾经学过的遗传都还给老师了。惭愧啊。

只有在囊胚期以前才管用(blastocyst)，就是胚胎那时候是个小球，外面的球壳将来会变成胎盘的一部分，里面的细胞将来会发育成整个胚胎和卵黄囊。这个阶段的胚胎只进行了trophoblast和inner cell mass的分化（trophoblast就是未来的胎盘组织原细胞，inner cell mass是未来的整个胚胎和卵黄囊）。在这个阶段的时候，把ES cell注射进这个小球的空腔里，这些ES cell的后代将来就能掺进胚胎的所有组织中去。事实上，ES cell就是从囊胚里取出来的。用immunosurgery的方法溶掉外面一层细胞，把里面的细胞用特别的培养基培养，就会长出colony，长到一定程度就传代，然后不停的传个二三十代，细胞的形态没有变化，表达了ES cell相关的marker，水平也没有变化，就说明ES cell line建立起来了。

老鼠的胚胎发育是这样的：精子在输卵管里碰上卵细胞，然后两个核融合，一个变两个，两个变八个，八个变十六个，十六个变三十二个。。。到这个阶段还是一团松松的细胞球儿。在三十二到六十四之间，细胞球会突然压缩，压缩成一个很紧的球体，球体里边出来一个空腔，这就是blastocyst了。这时候大约是受精以后三到四天的事。这时候blastocyst已经到了子宫，开始削尖脑袋往子宫的膜里钻，到5.5天的时候完全钻进去。所以用老鼠代母怀孕，只要给母老鼠用激素造成假怀孕使子宫ready，到了合适的时候就可以给老鼠做个手术（这我做不了，是技术员做的）,把囊胚注进老鼠的输卵管，然后它就可以自己钻进去继续往后发育。理论上来说哺乳动物都可以这么操作，但是不同的哺乳动物的胎盘和胚胎发育很不同，所以要克隆这克隆那还是挺有难度的。

我的生理、解剖也都还给老师了。发育是半路出家，还总是要翻课本

要让注射进去的DNA发生重组，暂时没有什么特别好的通用的办法，就是靠海量筛选，靠antibiotic markers筛选。把一段线状的带有antibiotic marker的DNA用电穿孔的方法打进ES cell里。象我用的方法一次要打两百万到一千万个细胞。这段DNA必须有足够长的与想打进去位点同源的两臂，就是相同的ＤＮＡ序列。一般来说两臂加起来要至少3kb。当然也有些神奇实验室报告500bp足够的，但是我想一般学生不想搭上自己的血泪时间省掉这2.5kb。这跟其它生物比的确是效率十分低：我以前做酵母的时候，有50bp就足够了。两臂越长，在上边发生重组的机会就越大。把这些电穿了孔的细胞收集起来，先让它们喘息一天，然后就开始上抗生素。在抗生素培养基里长一段时间（如果是卡那霉素，大约是十天到十二天。puromycin会短一些，hygromycin要长一些），没发生重组的那些都死掉了，发生了重组的会长成一个细菌一样的克隆斑，不过大得多。这时候就要收集几百个，养多一些，冻起来，留下一部分提取DNA，好确定哪些个的基因型正确，marker没有随便跑到基因组的别的什么角落。等确定了，就可以用这一个cell line来注射老鼠胚胎了。正常情况下，这一套做下来大约需要一个月的时间，如果用southern blot来确定基因型的话。southern blot是最值得信赖的方法，但是大家都不愿意做，因为要用同位素。

做gene targeting这一步挺碰运气的，因为有些位点就特别容易，有些位点就特别难，因为染色体结构的关系。有人筛一百个antibiotic resistant clones，有二十个是；有人做四百个，有一个是。我还听说过有人做了一千个，一个都没有的呐。我的运气介于中间：大约1比100的样子。

真是拼体力的实验啊。做出来很有成就感吧？

那下一步跟cre老鼠杂交，是用纯合体？cre老鼠是有卖的吧？

那是啊，在southern blot的膜上看到期盼的带型恨不得奔走相告，仰天长啸呀。

Cre老鼠一般用杂合体就够了，loxP老鼠如果是想看heterozygous的，那么杂合也够了。如果要homozygous deletion，一般不用loxP/loxp纯合，因为这样两条染色体同时被cre乱切一通，可能会接出错来，然后细胞就死了，就不是想要的phenotype了。一般是先做出一个loxp/-，再用这个跟cre杂交。

Cre老鼠一般来说不用买，可以直接跟人要。如果不是刚好有仇，都是会给的。世界上有一帮人致力于做loxP,有一帮人致力于做cre。把Cre安插在不同promoter或者enhancer－promoter组合后边，可以在不同的组织里表达。还可以给cre装一个最简promoter，在前边安一个tamoxifen-inducible element。这样，不注射tamoxifen cre就不表达，一注射它就表达了。我们这里有好几个大牛老鼠实验室，我要的好几个Cre老鼠他们都有，得到许可以后，技术员直接从他们笼子里拎一只杂种公过来就可以了。

好玩儿的是大家都尽量用白老鼠当妈，黑老鼠当爸。白老鼠又能生，又勤快（我的上一窝繁殖有23个，这一窝有16个 ）黑老鼠一般也就是生五六个，还经常发脾气，动不动就吃光。这些实验室老鼠“野生型”太纯合了，有些有点儿神经兮兮的。

哇，mice里面还有这么多学问哪。那个黑老鼠是否著名的黑6？

对，就是著名的黑6，庞克老鼠，不爱当妈。
我顶喜欢的野生型毛色是一种类似银色的 不知道叫什么，当时年幼识浅，只见过一面。而且个头也很大。

森林的火焰 wrote:著名的黑6，庞克老鼠，不爱当妈

恭喜火焰啊，求黑老鼠来黑老鼠

另拜这个庞克老鼠，太酷了

我看到分子那一部分就摩拳擦掌的，呵呵。
Southern Blot你们不试试用non-radioactive的办法么，比如用DIG标记探针什么的，可以省去用同位素的麻烦。
我老板经常痛说革命家史。现在提DNA都用kit，可以方便很多。20年前没那么便当，从文库里筛克隆常用colonu hybridization---用一个无菌的丝绒“图章”，做几个复印版，然后用其中一个做杂交，筛到阳性的，再到另一个存档的复印版上来取出。这种方法可以一天筛上千个克隆。

DIG标记可以用，但是在筛基因组ＤＮＡ的时候还是同位素最灵敏。哺乳动物基因组大，总ＤＮＡ里目标分子的数量太少，别的都不如32P灵。所以做别的目的的southern可以用DIG，但是筛目标克隆ES cell的不行。算着起码要有10微克的总DNA，才能达到southern blot能检测到的的最低限。
复印版那个我做过酵母的，有一个大图章似的道具，蒙上滤纸或者布再绷紧。用来筛对某种药物或者氨基酸缺失敏感的克隆，至今还是很有用的方法。当然筛文库用不着这么麻烦了。然后就不禁想：早年间塑料还不普及的时候，这个东西是什么做的？不是象牙的罢？
蚕你有合成过大分子蛋白没有？我现在致力于检测TAF1（Tata box associating factor I)，200多kDa，不知道为什么转一个质粒进细胞却检测不到表达出来的蛋白。抗体又不对，我要买老鼠的结果只找到人的。头疼ing。下面更不用说还要拿这个来做co-IP。

这个转进质粒但蛋白不表达，复杂了去了。我不太懂ES细胞，就算大肠杆菌也常见呢。
如果抗体是肯定能识别，真是检测不出来蛋白，可以考虑的有很多方面。第一蛋白的稳定性---会不会被endogenous的proteases给吃掉了，如果有表达的话。其次有时加码一个蛋白，劲儿太大，把本身的翻译表达机制给堵了，反而得不到需要的蛋白，在细菌体系里可以减低温度等，让表达放缓点儿之类。